Pamela Tan

The ER protein tapasin (Tpn) forms a bridge between MHC class I H chain (HC)/beta(2)-microglobulin and the TAP peptide transporter. The function of this TAP-associated complex was unclear because it was reported that soluble Tpn that has lost TAP interaction would be fully competent in terms of peptide loading and Ag presentation. We found, however, that only wild-type human Tpn (hTpn), but not three soluble hTpn variants, a transmembrane domain point mutant of hTpn (L410-->F), wild-type mouse Tpn, nor a mouse-human Tpn hybrid, fully up-regulated peptide-dependent Bw4 epitopes when expressed in Tpn-deficient.220.B*4402 cells. Consistent with suboptimal peptide loading, the t(1/2) of class I molecules was considerably reduced in the presence of soluble hTpn, hTpn-L410F, and murine Tpn. Furthermore, eluted peptide spectra and the class I-mediated inhibition of NK clones showed distinct differences to the hTpn transfectant. Only wild-type hTpn efficiently recruited HC and calreticulin (Crt) into complexes with TAP and endoplasmic reticulum p57 (ERp57). The L410F mutant was defective in TAP association, but bound to class I molecules, Crt, and ERp57. Mouse Tpn associated with human TAP and ERp57 on the one hand, and with HC and Crt on the other, but failed to recruit normal amounts of HLA class I molecules into the TAP complex. We conclude that the loading with peptides conferring high stability requires the Tpn-mediated introduction of HC into the TAP complex, whereas the mere interaction with Tpn is not sufficient.

Zusammenfassung Infizierte Zellen präsentieren dem Immunsystem auf ihrer Zelloberfläche antigene Peptide, die aus eingedrungenen Pathogenen generiert werden. Der Präsentation der Peptide geht die korrekte Assemblierung des MHC-Peptid- Komplexes im Endoplasmatischen Retikulum (ER) voraus. Innerhalb dieser Arbeit wird gezeigt, daß das ER-residente Protein Tapasin die Peptidbeladung auf MHC- Klasse-I-Moleküle sowohl in quantitativen als auch in qualitativen Aspekten positiv beeinflußt. Die Rekonstitution der Peptidbeladung in der B-lymphoblastoiden Zelllinie 721.220 durch die Expression von Tapasin führt auf der Plasmamembran der Zellen zu einer Steigerung der Menge an langlebigen MHC-Klasse-I-Molekülen, an die Peptide optimaler Länge binden. Die Selektion stabiler MHC-Peptid-Komplexe geschieht durch Tapasin im ER, indem das MHC-Klasse-I-Molekül in einen TAP-assoziierten Beladungskomplex rekrutiert und dort die Peptidbeladung optimiert wird. Tapasin induziert zunächst die Bildung zweier Subkomplexe: zum einen wird Calretikulin an das MHC-Molekül rekrutiert, zum anderen wird die Thioreduktase ER60 Tapasin- vermittelt an TAP gebunden. Die Tapasin-vermittelte Brückenbildung zwischen diesen beiden Subkomplexen führt auf den untersuchten HLA-B*4402- und HLA-B8-Molekülen zur verbesserten Ausbildung allospezifischer Bw4-/Bw6-Epitope. Lösliche Tapasin-Konstrukte und Maus-Tapasin sind nicht in der Lage, den vollständigen Beladungskomplex aus dem MHC-Klasse-I-Molekül, Calretikulin, ER60 und TAP zu assemblieren. Die in diesen Fällen suboptimale Peptidbeladung ist durch eine kürzere Lebensdauer an der Zelloberfläche und eine geringere Thermostabilität der MHC-Moleküle im Lysat gekennzeichnet. Mit den Ergebnissen dieser Arbeit kann Tapasin in funktionelle Domänen eingeteilt werden. Es wurde gezeigt, daß die N-terminale Domäne von Tapasin für die Peptidbeladung auf HLA-B8 und HLA-B*4402 Moleküle essentiell ist. Schon die Deletion von 19 Aminosäuren am N-Terminus von Tapasin verhindert die Plasmamembran-expression dieser MHC-Moleküle. Unverkürztes Humanes und murines Tapasin sind darüberhinaus in der Lage, die Expression von TAP über ihre Membranregion bis auf das 10fache zu steigern. Fehlt die Membran- und zytoplasmatische Domäne, ist keine Steigerung der TAP-Expression nachweisbar. Die Unterbrechung eines Leucin-Reißverschlußmotivs im Transmembranbereich von Tapasin durch den Aminosäureaustausch L410F hebt die ER-Retention von Tapasin teilweise auf und führt zu einem um 70-80% erniedrigten TAP-Expressionsniveau.