Martin Ritthaler

Activation of Wnt/beta-catenin target genes is regulated by a heterodimer of beta-catenin and the high mobility group box transcription factors of the lymphoid enhancer factor (LEF)/T-cell factor (TCF) family. In vertebrates, four LEF/TCF family members have been identified. They all contain a conserved beta-catenin-binding motif at the N terminus and a highly conserved high mobility group box for DNA binding. The core sequence between these motifs is less conserved and contributes to the specific properties of the individual family members. To identify interacting proteins that allocate specific functions to the individual LEF/TCF transcription factors, we performed a yeast two-hybrid screen using the less conserved core sequence as bait. We isolated the murine LIM protein HIC-5 (hydrogen peroxide-induced clone 5; also termed ARA-55 (androgen receptor activator of 55 kDa)) and cloned the highly conserved Xenopus homolog. In addition, we report that the LIM domain-containing C-terminal half of HIC-5 binds to a conserved alternatively spliced exon in LEF/TCF transcription factors. Our functional analyses revealed that HIC-5 acts as negative regulator of a subset of LEF/TCF family members, which have been characterized as activators in reporter gene analyses and in the Xenopus axis induction assay. In addition, we observed a repressive interference of LEF/TCF family members with HIC-5-mediated activation of glucocorticoid-driven transcription, which again could be allocated to specific LEF/TCF subtypes. With the characterization of HIC-5 as a binding partner of the alternatively spliced exon in LEF/TCF transcription factors, we identified a novel molecular mechanism in the dialog of steroid and canonical Wnt signaling that is LEF/TCF subtype-dependent.

Cnidarians surprise by the completeness of Wnt gene subfamilies (11) expressed in an overlapping pattern along the anterior-posterior axis. While the functional conservation of canonical Wnt-signaling components in cnidarian gastrulation and organizer formation is evident, a role of Nematostella Wnts in noncanonical Wnt-signaling has not been shown so far. In Xenopus, noncanonical Wnt-5a/Ror2 and Wnt-11 (PCP) signaling are distinguishable by different morphant phenotypes. They differ in PAPC regulation, cell polarization, cell protrusion formation, and the so far not reported reorientation of the microtubules. Based on these readouts, we investigated the evolutionary conservation of Wnt-11 and Wnt-5a function in rescue experiments with Nematostella orthologs and Xenopus morphants. Our results revealed that NvWnt-5 and -11 exhibited distinct noncanonical Wnt activities by disturbing convergent extension movements. However, NvWnt-5 rescued XWnt-11 and NvWnt-11 specifically XWnt-5a depleted embryos. This unexpected 'inverse' activity suggests that specific structures in Wnt ligands are important for receptor complex recognition in Wnt-signaling. Although we can only speculate on the identity of the underlying recognition motifs, it is likely that these crucial structural features have already been established in the common ancestor of cnidarians and vertebrates and were conserved throughout metazoan evolution.

Die Ausbildung des Blastoporus und die Etablierung eines Organisatorzentrums ist ein entscheidender Moment in der Embryonalentwicklung. Der dafür notwendige Symmetriebruch erfolgt in den meisten rezenten Metazoen durch eine lokale Stabilisierung von beta-Catenin und scheint auch in basalen Stämmen wie Schwämmen und Nesseltieren konserviert. Dies verdeutlicht die enorme Bedeutung des kanonischen Wnt-Signalwegs für die frühe Entwicklung. Die Existenz von Homologen aller aus Bilateriern bekannten Wnt-Gene, mit Ausnahme von Wnt9, in der basalen Seeanemone Nematostella vectensis überrascht. Jedoch legt die Expression der Wnt-Liganden eine Beteiligung an unterschiedlichen Entwicklungsprozessen nahe. Die Identifikation von Komponenten des nicht-kanonischen Wnt/PCP-Signalwegs deutet außerdem darauf hin, dass es bereits in der Evolution der Cnidarier zu einer Trennung von kanonischen und nicht-kanonischen Signalwegen kam. Da sich die Nematostella Wnt-Liganden relativ einfach in die verschiedenen Unterfamilien einteilen lassen, wurde in funktionellen Studien mit heterologen Systemen versucht, die Wnt-Gene dem Wnt/beta-Catenin- oder Wnt/PCP-Signalweg zuzuordnen. Von den hier untersuchten Wnt-Genen lieferte lediglich Wnt1, jedoch nicht das in Bilateriern kanonische Wnt3, einen verlässlichen Hinweis auf die Aktivierung des kanonischen Signalwegs im Achseninduktionsassay in Xenopus laevis und für den TOP-Flash-Reporter im Zellkultursystem. Weitere Ergebnisse zeigen darüber hinaus, dass NvWnt5 und NvWnt11 die konvergente Extension im Frosch beeinflussen, also den nicht-kanonischen Wnt-Signalweg bedienen. Interessanterweise scheint jedoch die genaue Funktion der beiden Gene vertauscht, da NvWnt5 die Depletion von endogenem XlWnt11 retten kann, bzw. NvWnt11 die Depletion von XlWnt5. Der Vergleich der in der Literatur beschriebenen Expressionsmuster mit der hier erstellten Kinetik brachte neue Ergebnisse für die Wnt-Expression. Durch die höhere Sensitivität der RT-PCR-Methode konnten die Transkripte von NvWnt5, -7a, -7b, -8b und -11 bereits maternal nachgewiesen werden. Die weitere Expression aller Wnt-Gene im Blastula-Stadium deutet außerdem auf die Etablierung eines Organisationszentrums durch die Liganden hin, wobei die verschiedenen Wnt-Gene entweder durch redundante Funktionen eine höhere Robustheit des Zentrums gewährleisten oder an einer Feinjustierung beteiligt sind. In weiteren Experimenten wurde schließlich die endogene Funktion von NvWnt3 und -11 untersucht, deren Bilaterier-Homologe sich stereotypisch kanonisch bzw. nicht-kanonisch verhalten. Dabei zeigte die Depletion NvWnt3 durch einen Morpholino keine Effekte auf die frühe Entwicklung, sondern äußerte sich in einer fehlenden Metamorphose zum Primärpolypen. Dadurch verharrten die Tiere in einem „Dauerblastula“-artigem Zustand ohne erkennbare Körperachse, bei dem ungeordnetes Mesenchym unter einer prospektiven Ektodermschicht zu erkennen war. Verantwortlich für diesen Phänotyp scheint die Repression des Forkhead-Transkriptionfaktors zu sein, der in Nematostella die epithelial-mesenchymalen Übergänge reguliert. Da sonstige Wnt-Zielgene in der RT-PCR unbeeinflusst schienen, spricht dies für eine sehr spezifische Rolle von Wnt3 in Nematostella. Die hier beschriebene maternale Expression von NvWnt11 erinnert an die Situation im Frosch, bei der maternales XlWnt11 für die Etablierung der dorso-ventralen Achse benötigt wird. Die Kolokalisation mit anderen Komponenten des Wnt-Signalwegs am zukünftigen oralen Pol in der Blastula deutet eine ähnliche Rolle von Wnt11 an der Achsenspezifizierung in Nematostella an. Die Repression von Wnt-Zielgenen sowie Endoderm-Markern durch den NvWnt11-Morpholino sprechen außerdem für eine überraschende Funktion von Wnt11 im Wnt/beta-Catenin-Signalweg. Die Kompensation sowohl morphologischer als auch genregulatorischer Effekte des Morpholinos durch eine Stabilisation von beta-Catenin mit Alsterpaullone sind ein weiterer Hinweis auf eine Beteiligung von NvWnt11 am kanonischen Signalweg. Da der Morpholino jedoch auch die Depletion des Wnt/PCP-Rezeptors Strabismus phänokopiert, kann von einer dualen Funktion von NvWnt11 sowohl im kanonischen als auch im nicht-kanonischen Weg ausgegangen werden.