Développement d'un biosenseur pour l'étude de l'activation de la GTPase RhoB par complémentation split-GFP tripartite

Abstract

RhoB est une petite GTPase rapidement activee par les facteurs de croissance et les stress cellulaires, qui regule des processus biologiques fondamentaux comme la migration, l'angiogenese, la reparation de l'ADN, l'apoptose ainsi que la reponse a des therapeutiques anticancereuses. L'activite des petites GTPases est finement regulee par leur localisation subcellulaire. Cependant, l'activation de RhoB en cellules vivantes n'avait jamais ete investiguee. Ce travail a permis d'adapter et de valider une methode innovante d'analyse des interactions proteine-proteine par complementation split-GFP tripartite, pour la detection sensible et specifique de l'activation des petites GTPases en cellules vivantes. Nous avons ensuite developpe un modele cellulaire optimise par la combinaison de la technologie split-GFP tripartite et d'un intracorps anti-GFP amplificateur de fluorescence, pour detecter la regulation de l'activation de RhoB avec une haute resolution spatiale. Ce biosenseur a mis en evidence la translocation de la forme active de RhoB en reponse au serum a partir des endosomes pour s'accumuler au niveau de la membrane plasmique, revelant ainsi une nouvelle plateforme de signalisation membranaire de RhoB. Ce biosenseur permettra d'analyser le profil d'activation de RhoB et d'autres petites GTPases, sous d'autres stimulations ou dans differents contextes cellulaires, et d'identifier leurs partenaires et les modulateurs de leur activation.