Alexis Brugier

We recently identified the scaffolding RACK1 protein as an important host-dependency factor for dengue virus (DENV), a positive-stranded RNA virus responsible for the most prevalent mosquito-borne viral disease worldwide. Here, we have performed the first RACK1 interactome in human cells and identified Vigilin and SERBP1 as DENV host-dependency factors. Both are RNA-binding proteins that interact with the DENV RNA to regulate viral replication. Importantly, Vigilin and SERBP1 interact with RACK1 and the DENV viral RNA (vRNA) to mediate viral replication. Overall, our results suggest that RACK1 acts as a binding platform at the surface of the 40S ribosomal subunit to recruit Vigilin and SERBP1, which may therefore function as linkers between the viral RNA and the translation machinery to facilitate infection.

Chikungunya is an infectious disease caused by the chikungunya virus (CHIKV), an alphavirus transmitted to humans by Aedes mosquitoes, and for which there is no licensed vaccine nor antiviral treatments. By using a loss-of-function genetic screen, we have recently identified the FHL1 protein as an essential host factor for CHIKV tropism and pathogenesis. FHL1 is highly expressed in muscles cells and fibroblasts, the main CHIKV-target cells. FHL1 interacts with the viral protein nsP3 and plays a critical role in CHIKV genome amplification. Experiments in vivo performed in FHL1-deficient mice have shown that these animals are resistant to infection and do not develop muscular lesions. Altogether these observations, published in the journal Nature [1], show that FHL1 is a key host factor for CHIKV pathogenesis and identify the interaction between FHL1 and nsP3 as a promising target for the development of new antiviral strategies.

Abstract Dengue virus (DENV), a re-emerging virus transmitted by Aedes mosquitoes, causes severe pathogenesis in humans. No effective treatment is available against this virus. We recently identified the scaffold protein RACK1 as a component of the DENV replication complex, a macromolecular complex essential for viral genome amplification. Here, we show that RACK1 is important for DENV infection. RACK1 mediates DENV replication through binding to the 40S ribosomal subunit. Mass spectrometry analysis of RACK1 partners coupled to a loss-of-function screen identified the RNA binding proteins Vigilin and SERBP1 as DENV host dependency factors. Vigilin and SERBP1 interact with DENV viral RNA (vRNA), forming a ternary complex with RACK1 to mediate viral replication. Overall, our results indicate that RACK1 recruits Vigilin and SERBP1, linking the DENV vRNA to the translation machinery for optimal translation and replication.

Le virus de la dengue (DENV) est un virus réémergent transmis par le moustique tigre et responsable de pathologies sévères potentiellement mortelles chez l'Homme. A ce jour, il n'existe aucun vaccin préventif ou traitement antiviral curatif efficace contre cet arbovirus, ce qui est dû en partie à une compréhension encore incomplète de son cycle infectieux. Le DENV est un parasite intracellulaire obligatoire qui dépend entièrement des facteurs cellulaires de son hôte pour se multiplier. Cette « dépendance cellulaire » constitue un talon d'Achille du virus qui peut être exploitée pour développer de nouvelles stratégies thérapeutiques. Mon travail de thèse s'est focalisé sur l'étude des mécanismes cellulaires et moléculaires par lesquels la protéine cellulaire RACK1 facilite l'infection de cellules humaines par DENV. RACK1 est une protéine cellulaire cytoplasmique qui a été récemment identifié par mon laboratoire d'accueil comme un composant du complexe de réplication du DENV, une structure multi protéique essentielle à l'amplification du génome du virus. Les études fonctionnelles de mon laboratoire d'accueil ont montré que RACK1 agissait comme un facteur proviral du DENV, cependant son rôle exact dans le mécanisme de réplication virale reste encore mal compris. RACK1 est une protéine d'échafaudage dont la forme majoritaire liée à la sous unité 40S du ribosome participe à la régulation de la traduction des ARNm et dont la forme minoritaire non ribosomale est impliquée dans la réponse immunitaire et la voie des interférons. Dans une première partie de mon travail, j'ai validé à l'aide de cellules éditées pour le gène RACK1 par la méthode CRISPR Cas9, l'importance de ce facteur cellulaire dans le cycle infectieux du DENV. J'ai pu ensuite montrer au moyen d'un mutant de RACK1 défectueux dans sa liaison au ribosome que l'interaction de RACK1 avec la sous unité 40S est cruciale pour l'infection par DENV. RACK1 étant une protéine d'échafaudage, nous avons émis l'hypothèse que sa fonction provirale sur le DENV pourrait dépendre de sa capacité à recruter des facteurs de l'hôte décisifs dans le bon déroulement du mécanisme de réplication virale. Dans une deuxième partie de mon travail, j'ai utilisé une approche de spectrométrie de masse pour caractériser l'interactome de RACK1 et identifier plus de 130 protéines cellulaires liant cette protéine ribosomale. Pour mieux définir la fonction de ces interactants de RACK1 sur la biologie du DENV, nous avons éteint leur expression par interférence ARN dans deux lignées cellulaires et déterminé les conséquences sur l'infection virale. Ce crible génétique a permis d'identifier les protéines Vigilin et SERBP1, deux facteurs de liaison de l'ARN, comme de nouveaux facteurs de dépendance du DENV. Dans une troisième partie, j'ai caractérisé le rôle accompli par ces deux protéines dans le cycle infectieux du DENV. J'ai généré des cellules dont l'expression de Vigilin et SERBP1 a été invalidé par CRISPR cas9 et montré que ces molécules agissaient à l'étape d'amplification de l'ARN viral du DENV sans affecter sa stabilité. J'ai finalement identifié les régions de Vigilin et SERBP1 importantes pour l'interaction avec RACK1 et montré que des protéines Vigilin et SERBP1 mutées au niveau du motif d'interaction avec RACK1 sont incapable de médier la réplication du DENV. L'ensemble de ces résultats montre que RACK1 forme un complexe ternaire avec Vigilin /SERP1 et l'ARN viral pour faciliter la réplication virale du DENV. En conclusion, mes travaux de thèse ont permis d'améliorer nos connaissances sur le cycle infectieux d'un arbovirus majeur en santé publique, le DENV. Mes résultats suggèrent que RACK1, Vigilin et SERBP1 régulent l'étape de réplication virale en facilitant la liaison des ARN viraux aux ribosomes pour optimiser la synthèse de nouvelles protéines virales.